Técnicas de Laboratório 2: Manutenção de cutelaria e vidraria, preparação de espécimes

2.1. Cutelaria

:Os instrumentos metálicos podem ser limpos em álcool a 95° , seguido de éter, guardados em recipiente forrado com papel de alumínio e contendo glicerina.

2.2. Limpeza de vidraria

A vidraria em geral pode ser lavada simplesmente com água, água e sabão ou por meio de soluções especiais, como o detergente Extran, solução de ácido nítrico a 10% ou ainda solução sulfocrômica.

O método clássico para limpeza de alta qualidade de vidraria, particularmente lâminas e lamínulas, consiste em colocá-las numa solução sulfocrômica, cujo preparo requer muito cuidado: a uma solução saturada de bicromato de potássio (500 ml) contida num balão de vidro refratário (há reação exotérmica), adicionar 900 ml de ácido sulfúrico lentamente, agitando e resfriando sob água corrente, até dissolver todo o precipitado de bicromato. Usar a solução enquanto os cristais de bicromato permanecem no fundo do recipiente. Uma fórmula mais simples é dada por Bradbury em 1973 (apud Sanderson, 1994)

Solução de bicromato de potássio a 3% ..................90 ml

Ácido sulfúrico concentrado................... ............... 10 ml

Após a imersão da vidraria em uma das soluções, lavar várias vezes em água corrente, finalizando com duas lavagens em água destilada. As lâminas podem ser estocadas em álcool absoluto ou álcool absoluto acidificado (100:1).

Os recipientes de vidro muito usados, podem ser mergulhados na solução sulfocrômica forte, sem tratamento prévio e na solução mais fraca recomenda-se ferver previamente a vidraria em água e sabão por cerca de 30 minutos e posteriormente colocá-la na solução sulfocrômica durante um ou dois dias

Atualmente as lâminas de boa qualidade são vendidas pré-lavadas e na maioria dos usos basta remover poeira e gordura, agitando-as em recipiente com álcool.

Em países tropicais as alterações de lâminas e lamínulas podem ser muito rápidas e deste modo, a superfície de vidro torna-se opalescente. Em certos casos a camada branca que se forma é solúvel em ácido, assim basta uma lavagem numa solução de álcool acidificado pelo ácido acético para que volte a transparência (100:1)

Em relação às lâminas usadas, sobretudo com preparações em algum meio de montagem, como bálsamo do Canadá, às vezes é mais econômico descartá-las, no entanto é possível recuperá-las da seguinte forma : colocar as lâminas em um recipiente de boca larga, com tampa esmerilhada contendo uma mistura em partes iguais de água, álcool a 95° e xilol; agita-se de tempos em tempos e usa-se à medida em que for precisando, tendo o cuidado de enxugá-las com um tecido bem limpo.

A secagem das lamínulas requer delicadeza, pois são muito frágeis, portanto é indicado enxugá-las segurando-as entre os dedos polegar e indicador da mão esquerda, se não for canhoto.

2.3. Preparação e observação de espécimes.

O estudo de protozoários geralmente é feito por meio de preparações à fresco, obtidas de infusões, de culturas mistas ou puras, quando são utilizados corantes vitais, supra-vitais e certas técnicas sem corantes. Mais adiante forneço algumas técnicas para este tipo de exame. No entanto várias observações são feitas em lâminas permanentes, onde os protozoários foram eventualmente anestesiados, depois fixados, corados e finalmente montados em um meio apropriado. As preparações de parasitos sanguíneos são feitas como esfregaço, sem meio de montagem ou lamínula, observados apenas com a objetiva de imersão. Numerosas técnicas para preparações permanentes são descritas por Langeron (1934) e Kudo (1985).

Na disciplina Zoologia I, a diversidade da vida animal é apreciada na zona entremarés de uma praia rochosa, cujo ambiente é favorável à vida das formas sésseis e sedentárias, como esponjas e cnidários, filos objeto de nosso estudo prático. Como a disciplina já tem organizada uma coleção de referência dos metazoários do local de estudo, praia da Pituba, na ocasião da excursão são coletados apenas novas ocorrências ou material de reposição, naturalmente com a orientação do professor acompanhante. Na tabela II apresento as técnicas básicas para anestesia, fixação e conservação dos principais grupos de animais marinhos, destinados a formar uma coleção para estudos morfológicos e taxinômicos.

Finalizo esta parte do texto, apresentando algumas técnicas específicas para esponjas e cnidários, a exemplo de preparações de espículas e de esqueleto para o primeiro filo e montagens totais e de cortes histológicos para o segundo.

2.3.1. Preparação de infusões.

Um mes antes da data prevista para exame em classe, devem ser preparadas as infusões, conforme as seguintes instruções :

Coloque uma boa quantidade de vegetais um vasilhame de vidro, previamente limpo, onde não tenha sido colocado nenhum fixador( formol, álcool, etc).

Ponha água, de preferência obtida em uma fonte natural.

Cubra o recipiente com gaze e prenda a mesma com cordão ou elástico.

Coloque a preparação em local iluminado.

2.3.2. Meio simples para cultura de Paramecium.

Você pode fazer meio simples para cultura e deve realizar repicagem quando as infusões ou culturas estão muito ricas . Para o meio de cultura, os passos são os seguintes:

Ferva por 20 minutos, 1000 mL de água de torneira com 4 a 6 gramas de capim ou alface cortadas em fragmentos de 2 a 3 cm.

A repicagem deve ser semanal; no entanto as culturas podem ser mantidas por meses, bastando adicionar, uma vez por mes, pequenos fragmentos de folhas previamente fervidas juntamente com um pouco do líquido.

2.3.3. Técnicas de observação

Para imobilização : solução Agar-agar 1 ou 1,5%, em estado líquido à 40°C (usar à temperatura ambiente).

Para diminuição dos movimentos : goma arábica a 0,5%; alginato de sódio a 0,5%.

Para anestesiar: fosfato monopotássico a 1,4%; álcool metílico a 10%; sulfato de magnésio a 33%; solução de Corri: álcool metílico a 96%(10 cc); água destilada (90cc); clorofórmio(3 gotas); sulfato de níquel a 0,1%(1 a 2 min. em saleira contendo 20 gotas de meio de cultura + 2 gotas do anestésico).

Para evitar a dessecação: bordear a lamínula com vaselina.

2.3.4. Soluções corantes para protozoários.

Colorações vitais são feitas por determinados corantes em altas diluições, os quais são acumulados em tecidos ou porções especiais da célula viva sem exercerem ação nociva sobre a mesma, enquanto uma coloração pós-vital é obtida por meio de um corante vital sobre células ou tecido extraídos de um animal vivo. A diferença básica consiste na reação ser em meio oxidante (pós-vital ) ou ao abrigo do ar ( vital), o que naturalmente dá resultados diferentes. Por exemplo, o verde janus só evidencia o condrioma após aeração.

As colorações vitais não são colorações propriamente ditas, pois o que existe é uma acumulação do corante em porções especiais da célula, que parece depender da carga elétrica da molécula corante. Os corantes eletro-positivos são básicos e os eletro-negativos são ácidos; o primeiros evidenciam estruturas eletro- negativas e os segundos, estruturas eletro-positivas. A coloração propriamente dita só ocorre após a morte da célula.

No estudo de protozoários, são usadas portanto, coloração vital, coloração propriamente dita, ou pós-mortem, assim como aplicação de um mordente, isto é, substância que age como intermediária entre corpos sem nenhuma afinidade química, propiciando uma combinação tripla entre tecido, mordente e corante.

Coloração vital : a maioria dos corantes é aplicada em concentrações muito baixas (0,01% ) a fim de diminuir a toxicidade sobre as células; são muito utilizados os seguintes corantes básicos, os mais adequados ao estudo de protozoários:

¨ azul de metileno (1: 10 000 = 0,01g em 100cm³ de água destilada) evidencia núcleo e grânulos citoplasmáticos eventualmente vacúolos.

¨ carmim em pó em diminutas quantidades para observação de tomada de alimento, vacúolos digestivos e movimento de ciclose dos mesmos em protozoários ciliados.

¨ vermelho neutro (1: 1 000= 100cm³ de água destilada + 0,01g de corante ou 1: 3 000 = 0,03g de corante em 100cm³ de água destilada) é indicador de pH e se acumula em vacúolos digestivos; quando pH é inferior a 7, a coloração apresenta-se vermelho forte quando o pH está nas zonas neutra e básica a coloração é amarelada.

¨ verde janus B (1: 10 000) evidencia o condrioma após um certo período de exposição ao ar; precedido pelo vermelho neutro o resultado é ainda melhor.

Coloração propriamente dita : os mesmos corantes vitais em concentrações elevadas ou em soluções alcoólicas ou acéticas, matam e coram protozoários; além disto outros corantes não vitais são usados, a exemplo de:

¨ verde de metila a 1% em ácido acético a 1%, cuja mistura deve ser preparada no momento de usar, na proporção 1:1, cora núcleos;

¨ solução cianopícrica, uma mistura de solução saturada de ácido pícrico (fixador) com traços de azul de anilina (corante), indicada para a observação da expulsão de tricocistos em ciliados.

¨ A solução de Noland atua, ao mesmo tempo, como fixador e corante:

Fenol saturado em solução aquosa - 80cm³

formol a 40% - 20cm³

glicerina - 4cm³

violeta de genciana - 20 mg

¨ Solução mordente : usa-se a solução de lugol para evidenciar flagelos, cílios, grânulos de glicogênio e cistos de parasitos intestinais; na preparação da fórmula abaixo, os sais são triturados e a água adicionada lentamente, até a dissolução total:

iodeto de potássio 2 g

iodo metálico sublimado 1 g

água destilada 200 ml

2.3.5. Preparação de metazoários.

A escolha da técnica fica condicionada ao propósito do estudo. Para estudos de taxinomia os animais são anestesiados, fixados e conservados e a partir daí a maioria dos grupos zoológicos requer preparações microscópicas. Basicamente são de dois tipos: montagens totais ou cortes, estes últimos destinados ao estudo de células e tecidos.

2.3.5.1. Preparação de soluções fixadoras e conservantes.

Para o estudo taxinômico da maioria dos grupos zoológicos, formol e álcool etílico são utilizados como fixadores e conservantes. A solução aquosa conhecida como formol ou formalina contém um gaz, aldeído fórmico (CH²O), que dissolve na água no máximo até 40% e é comercializado a 37%. Tem penetração rápida nos tecidos e poder coagulante sobre as proteínas, sendo portanto um bom fixador, mas cuja fixação é lenta. Também é bom conservante, pois sabe-se que tecidos podem nele permanecer por mais de 10 anos sem grandes modificações de suas estruturas. A fixação pelo álcool etílico é empregada sobretudo em anatomia vegetal e em histoquímica, sendo pouco recomendada na maioria de preparações de tecido animais. Porém, muitos metazoários destinados às coleções de museu são conservados em álcool. Em qualquer dos casos, o líquido fixador deve sempre ser substituído.

• Formol ou formalina - O termo formalina refere-se à solução diluida e formaldeído à solução estoque. Por exemplo, formol ou formalina a 10%, que é a diluição usual para fixação ( 90 ml de água e 10 ml da solução estoque), na realidade contém 4% de formaldeído.

A solução concentrada quando exposta à luz decompõe ácido fórmico e água, e a diluída usualmente é estocada com carbonato de cálcio, de magnésio para neutralização ou emprega-se o fixador tamponado com sais. Nunca adicione a solução estoque (formaldeído) a carbonatos, pois a evolução rápida de CO² pode explodir.

O soro para invertebrados em geral é na concentração de 0,6% de cloreto de sódio(NaCl) e para vertebrados 0,9%, enquanto que para organismos marinhos é suficiente a água do mar.

A formalina deve ser neutralizada próxima ao período de uso, pois este estado não é duradouro. Uma maneira prática e barata muito utilizada consiste em:

colocar na solução de formol uma gota de vermelho neutro a 1% ;

misturar com um bastão de vidro e notar a coloração vermelha, que indica pH ácido;

a seguir gotejar lentamente uma solução básica, por exemplo, hidróxido de potássio (KOH) a 10%, ao mesmo tempo em que se mistura as soluções;

continuar misturando até que a coloração mude para a faixa do amarelo, que indica um pH próximo da neutralidade.

Toda turbidez é indício da formação de paraformaldeído, o qual deve ser removido por filtração antes do uso.

O formol do comércio é um líquido incolor cujos vapores podem provocar comichão nos olhos, dermatite, diminuição da olfação e em certas pessoas, bronquite e febre, bem como endurecimento da epiderme. Portanto, a rigor a fixação deveria ser feita sob capela e evitar qualquer contato com a pele. Para o manuseio das peças conservadas em formol é necessário lavá-las em água corrente e em seguida enxaguá-las em água levemente amoniacal, a fim de suprimir o odor.

• Álcool etílico-

Geralmente emprega-se o alcoômetro para determinar a porcentagem de álcool absoluto numa mistura aquosa, pois diferentes concentrações de álcool tem diferentes densidades e específicas gravidades. Por isto o instrumento flutua mais para cima ou mais para baixo e a concentração aparece na escala . No entanto, nem sempre esse instrumento está disponível, por isto transcrevo de Langeron (1934) a tabela de diluição de Gay-Lussac (Tabela I)

2.3.5.2. Anestesia, fixação e conservação de animais marinhos.

As indicações contidas na tabela II referem-se à preparação de animais marinhos para formar uma coleção destinada ao estudo taxinômico. Isto porque os táxons contidos no programa de Zoologia I são predominantemente marinhos e a aula de campo sobre diversidade é feita num costão rochoso.

É importante assinalar que para cada grupo de metazoário há uma maneira adequada de usar o (s) anestésico (s). Por exemplo, no caso dos cnidários, animais estudados  em Zoologia I, esta etapa é crucial. Assim, a melhor forma de anestesiar  hidrozoários coloniais é despejando sobre a colônia com pólipos distendidos em um recipinte (com reduzida quantidade de água) uma solução 1:1 de água do mar e cloreto de magnésio a 7,5% (preparado em água destilada) (MIGOTTO, com.pess.). Quanto aos membros da classe Anthozoa, tem dado bons resultados a posterior aplicação do mesmo anestésico (cloreto de magnésio) em zoantídeos transportados ao laboratório, mantidos em aquário iluminado por lâmpada Gro-Lux (cujo espectro semelhante à luz solar) e uma vez distendidos, transferidos para pequenas cubas de vidro ou plástico com volume conhecido de água do mar e expostos à luz (Gro-lux), a fim de garantir que os pólipos fiquem abertos. Quando isto ocorre despeja-se o mesmo volume do anestésico a 7,5%, lentamente, mas todo de uma vez, com cuidado para não agitar demais a água do mar com a colônia ( ROHLFS DE MACEDO, 1986). Na ausência da lâmpada  mantenha as colônias sob arejamento (existem pequenas bombas à pilha) expostas à luz do sol e proceda como descrito acima. Para os demais membros dos antozoários, a proporção 1:1 (solução de MgCl2: água do mar ) deve ser mantida, assim como o modo de aplicação do anestésico  descrito para os zoantídeos.

No caso de preparações histológicas , além dos agentes fixadores citados, podem ser usados outros aldeídos, como paraformaldeído, glutaraldeído, acroleina, bem como o álcool metanol, acetona, ácidos acéticos e pícrico, freqüentemente em misturas. Por exemplo, o fixador microanatômico conhecido como Bouin, muito usado no estudo de invertebrados marinhos, contém ácido pícrico, formaldeído e ácido acético. No Brasil é necessária uma autorização do exército para a compra de ácido pícrico, provavelmente pelo risco de explosão se aquecido bruscamente.

Além do Bouin, são usados vários outros fixadores anatômicos, bem como citológicos. Após a aplicação de qualquer um desses fixadores, várias etapas se sucedem:

desidratação e clarificação;

banhos de parafina, em estufa;

inclusão em parafina, resina ou similar;

realização de cortes ao micrótomo;

montagem sobre lâmina;

remoção do meio de inclusão;

coloração e montagem em resina sintética

O estudo da morfologia interna de Anthozoa requer preparações histológicas e freqüentemente estas preparações são fundamentais na prática de identificação taxinômica dos mesmos.  Neste caso recomenda-se a utilização de uma solução fixadora nomeada Susa de Heidenhain ou Bouin aquoso ( este último apenas quando não é requerida a preservação de estruturas calcárias), e coloração pelo método tricrômico de Mallory ou Gomori. Fórmulas e procedimentos são encontrados em manuais de técnicas histológicas. Se você tem interesse em saber mais sobre técnicas histológicas, clique no site da FAFIS- Faculdade Adventista de Fisioterapia (Cachoeira, Bahia); lá há um bom texto sobre o assunto.

2.3.5.3. Esponjas: preparação de lâminas

a) Espículas calcárias isoladas

· Colocar um fragmento da esponja sobre lâmina e cobrir com lamínula.

· Com uma pipeta de Pasteur gotejar, junto à borda da lamínula, hipoclorito do sódio (Q- Boa) e deixar dissolver totalmente a peça.

· Lavar em água 2 a 3 vezes, depois com álcool a 95° e retirar os líquidos com tiras de papel de filtro, dispostas na borda oposta.

• Deixar secar sobre placa aquecedora, retirar cuidadosamente a lamínula e montar em resina sintética.

b) Espículas silicosas isoladas

• Substituir o hipoclorito de sódio por ácido nítrico concentrado e passar a preparação por uma chama de lamparina a álcool, sem lamínula e sob exaustão.
• Repetir o procedimento, evitando colocar o ácido na lâmina quente, até que a parte orgânica seja dissolvida.
• Lavar , cuidadosamente, 2 a 3 vezes com água de pisseta, seguida de jato de álcool a 95%
• Secar e montar..

Tabela I. Diluição de álcool etílico (Gay Lussac)

Fonte: Langeron, 1934.

c) Espongina

• Colocar pequenas fatias de esponja em amoníaco e deixar na estufa até o aparecimento das fibras.
• Lavar várias vezes e desidratar na série de álcool até o 95%
• Colocar 2 vezes em álcool butílico normal por cerca de 30 minutos em cada.
• Montar em resina sintética.

d) Cortes espessos : Demospongiae

• Fazer cortes com lâmina de barbear, perpendiculares e tangenciais à superfície da esponja conservada em via úmida ou seca.
• Desidratar e diafanizar em álcool butílico normal por cerca de 30 minutos
• Montar em resina sintética.

e) Cortes espessos : Calcarea

• Cortar longitudinalmente um exemplar conservado em álcool.
• Corar em fuccina ácida, solução alcoólica (80%) a 1%
• Desidratar em álcool a 95% (20 min) e butanol normal (2 vezes, 30 min)
• Colocar em 2 banhos de parafina 58 - 60° C (2 horas cada)
• Incluir em parafina e fazer cortes transversais com lâmina de barbear
• Retirar a parafina com xilol
• Montar em resina sintética.

2.3.5.4. Cnidaria : preparação de lâminas

a) Montagem total de hidróides

• Cortar uma porção da colônia conservada em álcool a 70% e/ou retirar uma hidromedusa do líquido conservante.
• Corar em carmim borácico* por cerca de 10 minutos
• Diferenciar em álcool-ácido**
• Desidratar em álcool a 90% por cerca de 10 minutos
• Completar a desidratação e fazer a diafanização em álcool butílico normal (2 vezes, 30 minutos cada)
• Montar em resina sintética

* Carmim borácico : solução de bórax a 4% (100ml) + carmim (1g) ; ferver até que o carmim se dissolva, adicionar 100ml de álcool a 70% e filtrar após 24 horas.

**Álcool -ácido : 4 gotas de ácido concentrado para 100 mL de álcool.

b) Preparação de lâminas de escleritos, esqueleto calcário.

• Colocar um pequeno pedaço de tecido em tubo de ensaio ou sobre lâmina e dispor gotas de hipoclorito de sódio para em poucos minutos dissolver o tecido.
• Lavar repetidas vezs com água, depois com álcool a 95%
• Deixar secar ou pipetar e colocar sobre lâmina, também permitindo a secagem completa.
• Montar em resina sintética.

c) Preparação de nematocistos de antozoários

• Obter fragmentos dos tentáculos, acôncios, filamentos gástricos ( preferencialmente de animal vivo) e dispor sobre lâminas com uma gota de água.
• Dissociar as estruturas com estiletes finos e contrastar com lugol, no caso de não haver microscópio contraste de fase.
• Cobrir com lamínula.

TABELA II : ANESTESIA, FIXAÇÃO E CONSERVAÇÃO DOS PRINCIPAIS GRUPOS DE METAZOÁRIOS MARINHOS - Subsídio à construção de coleções.

* Zenker : Bicloreto de mercúrio (5g) + bicromato de potássio (2,5g)+ sulfato de sódio (1g) + água destilada ( 100 ml) + ácido acético, adicionado no momento do uso (4ml).

Nota: os táxons grifados são os filos e formol N significa neutralizado.

Referências

KUDO, Richard R. Protozoologia. traducido por Aristeo Acosta Carreon. Mexico: Continental, 1985. 905p. il.

LANGERON, M. Précis de Microscopie. 5a. edição, Paris: Masson et Cie, 1934. 1205p.

ROHLFS DE MACEDO, C.M. Microanatomia e sistemática das espécies de Zoanthus Lamarck, 1801 (Cnidaria, Anthozoa, Zoanthidea) do litoral e ilhas oceânicas do Brasil. 1986.141p. il. Mestre em Ciências Biológicas, Área Zoologia, Museu Nacional/Universidade Federal do Rio de Janeiro.1986.

SANDERSON, J.B. Biological microtechnique. Preston: BIOS Scientific Publishers Limited, 1994. 224p.

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